ティラノサウルスの化石やモアイ像がお祭り騒ぎ!!
愉快で不思議な博物館へようこそ！

夜の博物館で恐竜の化石が動き出し、モアイ像がガムを食べ、ローマ皇帝とカウボーイがバトルを繰り広げる!? ワクワク・ドキドキのアドベンチャー・コメディーの大ヒットシリーズ第1作。物語の舞台となるのは、NYの自然史博物館。離婚して離れて暮らす息子の信頼を取り戻すため、博物館の夜警として働くことになったラリーは、夜な夜な展示物が動き出すことに気付き…！お祭り騒ぎの展示物たちのせいで、クビの危機に陥ったラリーはロビン・ウィリアムズ演じるルーズベルト大統領像に助けを借りて騒動を治めようしたところ、更に怪しい計画が進行しており、壮大な陰謀に立ち向かうことになる。ティラノサウルスや猿、古代エジプトの王子、ミニチュアのローマ皇帝やカウボーイたちが大騒ぎ！子どもから大人まで家族みんなで楽しめる、スリル満点のアドベンチャー・コメディー！

バツイチで失業中のラリー（ベン・スティラー）は、何をやってもうまくいかない男。離婚して離れて暮らす息子のニッキー（ジェイク・チェリー）を失望させないためにも職探しに奔走するラリーは、自然史博物館の夜間警備員として働くことに。ラリーを出迎えた先輩警備員のセシル（ディック・ヴァン・ダイク）、ガス（ミッキー・ルーニー）、レジナルド（ビル・コッブス）から引き継ぎを受け仕事に臨むが、しばらくして早速居眠りを始める…。ラリーが目覚めると、博物館内のティラノサウルスの骨格模型が動き出した!!

恐竜に追いかけられたり、モアイ像にからかわれたり、ミニチュア人形に囚われるなど散々な目にあうラリー。ろう人形のテディ・ルーズベルト大統領（ロビン・ウィリアムズ）に助けられ、なんとか一晩をやり過ごしたラリーは、博物館のガイドのレベッカ（カーラ・グギーノ）の助けを得て2日目の夜に向けて猛勉強を開始。しかしその夜も、猿のデクスターのイタズラのせいで館内は大変なことになってしまい…。仕事をクビになりそうなところを許してもらったラリーは、動き回る展示物を見せようとニッキーを夜の博物館に呼ぶが…。さらに、博物館では、ある怪しい計画が進行していた…。果たしてラリーはこの混乱を収め、博物館を守ることは出来るのか！？